Учёные впервые смогли детально проследить процесс запуска репликации ДНК внутри живых клеток с точностью до отдельных пар оснований.
Перед делением клетка должна полностью скопировать свой геном. Для этого задействуются специальные белковые моторы — хеликазы (от лат. helix — «спираль»), ферменты, разделяющие две цепи двойной спирали ДНК. Главный «молекулярный мотор», который расплетает структуру перед делением, — комплекс MCM2–7.
Этот комплекс собран из шести различных белков-субъединиц (от Mcm2 до Mcm7). В неактивном состоянии MCM2–7 состоит из шести субъединиц и формирует двойное кольцо вокруг ДНК в специфических точках старта. Ранее специалисты не могли точно зафиксировать в живой клетке момент, когда эти два кольца разделяются, где именно начинает расплетаться ДНК и как одна из цепей выходит наружу.
Механизм активации и роль белковых ворот
Чтобы пошагово зафиксировать переходный процесс, авторы работы применили методы химической генетики на клетках дрожжей. С помощью «молекулярных защёлок» исследователи соединили соседние субъединицы белка Mcm4 одного кольца и Mcm5 другого. Блокировка физического разделения колец привела к остановке клеточного цикла и снижению синтеза ДНК более чем на 70% через 60 минут после выхода из фазы покоя G1.
Это показало, что механический разрыв двойного кольца (гексамера) служит жёстким условием для своевременного высвобождения белков-активаторов Sld3 и Mcm10.
Изображение сгенерировано: Nano Banana
Исследование всех шести потенциальных интерфейсов белкового кольца выявило, что роль молекулярных ворот для выхода одной из цепей ДНК выполняет стык субъединиц Mcm2/5. Блокирование этого участка позволяет провести начальное плавление молекулы, но полностью останавливает дальнейшую элонгацию (продление синтеза), так как две активированные хеликазы физически не могут пройти мимо друг друга с закрытыми воротами. Нарушение работы этого интерфейса оказалось летальным для клеток.
Точка старта и динамика расплетения
Используя методы геномного картирования высочайшего разрешения (ChIP-Exo 5.0 и PIP-seq), специалисты установили, что первичное расплетение спирали стартует точно в центре — в точке контакта двух белковых колец. Структура ДНК в этом месте устроена особым образом: плотный центральный участок окружён фрагментами, которые легко поддаются разрыву. Из-за такой архитектуры спираль быстро деформируется и расходится под физическим давлением белкового мотора.
Анализ одноцепочечной ДНК показал появление первых расплетённых участков через 15 минут после перехода клеток в фазу синтеза ДНК. Авторы работы проследили, как область контакта белка с ДНК расширяется с 64 пар оснований до 72, а затем до 138 пар оснований при разделении колец и привлечении ферментов-полимераз.
Исследование впервые связало разрозненные шаги запуска копирования ДНК в единую пошаговую карту: от расхождения белковых колец и выталкивания одиночной нити через молекулярные ворота до разделения копирующих комплексов в разные стороны. Так как эти базовые белки устроены одинаково у дрожжей и человека, понимание точной механики процесса позволит выяснить, как клетки сохраняют стабильность генома и почему сбои на этапе удвоения ДНК приводят к опасным мутациям.
